一、石蠟切片
把修好的蠟塊裝在旋轉(zhuǎn)切片機(jī)上，即可進(jìn)行切片(section)。切片必須保持切片刀銳利，切片厚度通常為5～7um，也可根據(jù)染色需要切成不同厚度，一般不旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)超過10um。切好的蠟帶，放人40℃左右的溫水中將蠟片展平。良好的切片應(yīng)無刀痕、裂痕，切片厚度均一平整。切片如有上述問題，在進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象。
為能得到平整無皺褶的組織切片?？刹捎脙纱握蛊?，即先將組織切片漂浮在30％的乙醇溶液中進(jìn)行第一次展片，然后將切片撈起，再次放人45～50℃的水浴中進(jìn)行第二次展片，乙醇的濃度和水溫可視組織不同和石蠟熔點(diǎn)的高低自行調(diào)整。此過程是利用乙醇溶液與水之間的張力差展開切片的皺褶。
為防止脫片，載玻片要涂黏片劑。對(duì)HE染色的切片，可在載玻片上涂抹薄層蛋白甘油，但蛋白甘油因含蛋白易導(dǎo)致非特異性免疫反應(yīng)，故用于免疫組織化學(xué)染色的切片常用多聚賴氨酸、3—氨丙基—乙氧基甲硅烷等處理。
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二、冰凍切片
冰凍切片(frozen section)是酶組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色中最常用的一種切片方法，其最突出的優(yōu)點(diǎn)是能夠較完好地保存細(xì)胞膜表面和細(xì)胞內(nèi)多種酶活性,以及抗原的免疫活性，尤其是細(xì)胞表面抗原更應(yīng)采用冰凍切片。新鮮組織和已固定的組織均可作冰凍切片。為了得到高質(zhì)量的冰凍切片，選擇好的冰凍切片機(jī)和配套的一次性刀架是保證切片質(zhì)量的關(guān)鍵。組織在切片前需要冰凍，而冰凍過程容易使組織中的水分形成冰晶，從而影響抗原定位。一般認(rèn)為，冰晶體積大而量少時(shí)，影響較??；冰晶體積小而量多時(shí)，對(duì)組織結(jié)構(gòu)損害較大。含水量較多的組織中較易出現(xiàn)冰晶。
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1．防止組織中冰晶形成的方法
(1)速凍：使組織溫度驟降，減少冰晶的形成。方法包括：
? ? ?A:干冰—丙酮(乙醇)法：
將150～200ml丙酮(無水乙醇)裝入小保溫杯內(nèi)，逐漸加入干冰，直至飽和呈黏稠狀，再加干冰不再冒泡時(shí)，溫度可達(dá)-70℃，用一小燒杯內(nèi)裝異戊烷約50ml，將此燒杯緩慢置人干冰—丙酮(或無水乙醇)飽和液內(nèi)，至異戊烷溫度-70℃時(shí)即可使用。將組織(大小為lcm×0．8cm×0，5cm)投入異戊烷內(nèi)速凍30～60秒后取出，置恒冷箱內(nèi)以備切片，或置-80℃低溫冰箱內(nèi)貯存。
B:液氮法：
將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制錫紙小盒(直徑約2cm)，可適量加OCT包埋劑浸沒組織，然后將特制小盒緩緩平放人盛有液氮的小杯內(nèi)，當(dāng)盒底部接觸液氮時(shí)即開始汽化沸騰，此時(shí)小盒保持原位，切勿浸入液氮中，大約10～20秒后組織即迅速冰結(jié)成塊。取出冷凍的組織塊立即置人恒冷箱切片機(jī)冷凍切片或置人-80℃冰箱貯存備用。
(2)應(yīng)用蔗糖溶液：
將組織置于20％～30％蔗糖溶液l～3天，利用高滲吸收組織中水分，減少組織含水量，可防止或減少冰晶的形成。
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2．恒冷箱切片法
??? 冷凍后的組織塊即可用于恒冷箱切片，其過程包括以下步驟：
(1)組織包埋根據(jù)研究目的取所需組織(如切取小鼠肝臟1．0cm×l．0cm×0．5cm大小的組織塊)，用濾紙吸去多余水分，將組織塊平放于用特制錫紙小盒(直徑約2cm)或軟塑瓶蓋內(nèi)。加適量OCT包埋劑浸沒組織，40℃浸透20—30分鐘。為防止冰晶形成，包埋前可進(jìn)行蔗糖處理。
(2)組織冷凍：按上述干冰—丙酮(乙醇)法或液氮法冷凍組織。
(3)切片：
切片前1小時(shí)將恒冷箱切片機(jī)的溫度設(shè)定為-18℃左右，以備切片。切片時(shí)溫度以-15—-18℃為宜，溫度過低組織易破碎。刀的角度要適當(dāng),否則不易連片。用載玻片貼附組織切片時(shí)，勿上下移動(dòng)。未經(jīng)固定的新鮮組織在冰凍切片后應(yīng)使用相應(yīng)的固定劑固定10分鐘。冰凍切片后如不立即染色，必須用電風(fēng)扇吹干，貯存于-70℃低溫冰箱內(nèi)或進(jìn)行短暫預(yù)固定后低溫冰箱保存。染色前從冰箱內(nèi)取出切片，置室溫干燥10分鐘，再經(jīng)冷丙酮固定5～10分鐘(未固定者)，PBS漂洗3次后即可進(jìn)入染色程序(HE染色可用甲醛、冰醋酸和95％乙醇快速固定1—2分鐘)。
(4)冰凍切片的保存：
冰凍切片后如不能及時(shí)染色，可在干燥后裝入密封的標(biāo)本盒內(nèi)，外包塑料袋，貯存于低溫冰箱，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后于低溫冰箱保存。
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三、振動(dòng)切片
用振動(dòng)切片機(jī)(vibratome)可以把新鮮組織(不固定、不冷凍)切成20～400pm的厚片，或者切經(jīng)過固定的動(dòng)植物標(biāo)本。???? 以漂浮法在反應(yīng)板內(nèi)進(jìn)行組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)染色。因組織不冷凍，無冰晶形成也無組織抗原破壞，染色前又避免了組織脫水、透明、包埋等步驟對(duì)抗原的損害，故能較好地保留組織內(nèi)脂溶性物質(zhì)和細(xì)胞膜抗原。
振動(dòng)切片主要用于顯示神經(jīng)系統(tǒng)抗原分布的研究。對(duì)于柔軟的胚胎腦組織，可用低熔點(diǎn)(45—55℃)10％瓊脂糖包埋，振動(dòng)切片機(jī)切成厚片(40—100gm)，采用漂浮法在反應(yīng)板內(nèi)進(jìn)行免疫熒光組織化學(xué)染色，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。
振動(dòng)切片方法簡(jiǎn)單、快速，能使組織比較完整的保留，適合組織電生理學(xué)等研究。與冰凍切片相比，無需冰凍組織，不會(huì)形成冰晶或破壞組織抗原。與石蠟切片相比，不需要脫水、透明、浸蠟等過程，避免對(duì)抗原的損害。
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